9-芴甲醇的高效液相色谱分析
陈叶飞 张秀云（上海宝钢化工有限公司技术中心，上海200942)
9-芴甲醇可用于制取氯代甲酸-9-芴甲酯(Fmoc -C1)、 9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(Fmoc-Osu)等。Fmoc-Cl和 Fmoc-Osu是多肽合成中的氨基保护剂，在多肽合成中有独特的作用。因此，随着生物制药领域的不断发展，对9-芴甲醇的需求量将大幅增加。目前，国内外已有多家研究单位进行了9-芴甲醇合成方法的研究，在简化合成步骤、降低生产成本方面取得很大进展，但对其含量的测定方法尚未见文献报道。本文采用了高效液相色谱直接进样方法来测定9-芴甲醇的含量。
1 试验部分
1.1 主要仪器和试剂
Agilent 1100型高效色谱仪，配备在线真空脱气机，四元梯度泵，20μL手动进样器，多波长紫外检测器，柱温箱，Agilent 1100化学工作站。
9-芴甲醇对照品，比利时ACROS公司提供，产品编号A0182055，纯度99.8%。样品经过红外光谱、质谱、核磁共振谱表征，并与标准谱图比较，结构得到确认。甲醇（色谱纯）购自上海国药集团。实验中流动相和溶液用水均为二次蒸馏水。
对照样品溶液：称取9-芴甲醇对照品25mg（称准至0.01 mg）于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，用超声波脱气溶解10min ,混合摇匀。
待测样品溶液：称取9-芴甲醇试样25mg于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，用超声波脱气溶解l0min，混合摇匀。
1.2 色谱条件
色谱柱：Inertsil ODS-3，流动相：甲醇︰水＝90︰10（体积比）；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm 。
2 结果与讨论
2.1 谱图与计算
吸取对照样品和待测样品溶液各20μL，注入高效液相色谱，得到的色谱图见图1、 2，分离度和峰形都很好。
9-芴甲醇的含量按如下公式计算：
X1＝X标×(A1/A2)(m2/m1)
式中的X1为试样中9-芴甲醇的含量，％；X标为标样中9-芴甲醇的含量，％；A1为试样中9-芴甲醇组分的峰面积；A2为标样中9-芴甲醇组分的峰面积；m1为试样的质量，g；m2为标样的质量，g。
2.2 精密度
称取0.02130g试样溶于50mL容量瓶中，试样浓度0.426mg/mL。同一操作者对实际试样平行测定5次，得芴甲醇含量平均值93.13%。精密度结果见表1。
表1 精密度测试结果
|
编 号 |
峰面积 |
含量，％ |
|
1 |
9721.0 |
92.69 |
|
2 |
9784.8 |
93.31 |
|
3 |
9752.7 |
93.16 |
|
4 |
9756.0 |
93.19 |
|
5 |
9767.2 |
93.30 |
|
相对标准偏差(RSD),% |
0.214 |
|
从表1中可看出, 测定试样时含量的RSD只有0.214%，说明该方法精密度很高，随机误差小。
2.3 加标回收率
采用同一样品加入2个水平的对照样。首先称取0.01387g平均含量93.13％的试样，加人10mL 1.9757mg/mL对照品，溶解到100mL容量瓶中，按2.1所述方法测定含量，重复实验5次，计算回收率。然后称取0.02199g平均含量93.13％的试样，加入20mL 1.9757mg/mL对照品，溶解到100mL容量瓶中，测定含量，重复实验5次，计算回收率。加标回收率的实验结果见表2。
表2 加标回收率的试验结果
|
编号 |
试样应测面积 |
标样应测面积 |
实测面积 |
实际回收面积 |
回收率，％ |
|
加标1 |
3234.663 |
4923.053 |
7984.6 |
4749.937 |
96.48 |
|
8047.3 |
4812.637 |
97.76 |
|
7966.7 |
4732.037 |
96.12 |
|
7980.2 |
4745.540 |
96.39 |
|
7975.6 |
4740.940 |
96.30 |
|
加标2 |
5100.6 |
9727.53 |
14595.3 |
9494.7 |
97.61 |
|
14644.1 |
9543.5 |
98.11 |
|
14355.4 |
9254.8 |
95.14 |
|
14349.9 |
9249.3 |
95.08 |
|
14385.4 |
9284.8 |
95.56 |
从表2中可知，不同水平的加标回收率在95.08%～98.11％之间，回收率都比较高，表明用该方法测定9-芴甲醇含量的准确性高。
3 结论
高效液相色谱测定9-芴甲醇，其精密度和准确性高，方法简单，易于操作，实际样品的测定结果较准确。
